Nato a O’ Fallon - nell’Illinois – nell’aprile 1918, viene notato in una produzione teatrale all’epoca del college e nel ’36, a soli diciotto anni, viene messo sotto contratto sia dalla Paramount che dalla Columbia. Dopo il suo esordio in qualche ruolo minore - Prison Farm (1938) di Louis King, Million Dollar Legs (1939) di Nick Grinde, Strisce invisibili (1939) di Lloyd Bacon - ottiene il suo primo ruolo da protagonista nelle vesti di un violinista-boxeur in Passione - Il ragazzo d’oro (1939) di Rouben Mamoulian, rivelando un notevole talento.

Dopo qualche altro film - La nostra città (1940) di Sam Wood, tratto dalla pièce teatrale di Thornton Wilder La piccola città (1938), Arizona (1940) di Wesley Ruggles, Texas (1941) di George Marshall, con Glenn Ford, I cavalieri del cielo (1941) di Mitchell Leisen, con Ray Milland e un’esordiente Veronica Lake -, si arruola nei paracadutisti nella Seconda guerra mondiale e torna con il grado di tenente.

Dopo la guerra interpreta numerosi film - Bagliore a mezzogiorno (1947) - di John Farrow, con Anne Baxter e Sterling Hayden, Non si può continuare a uccidere (1948, conosciuto anche con il titolo L’uomo del Colorado)  di Henry Levin, con Glenn Ford, Il vagabondo della foresta (1948) di Norman Foster, con Loretta Young e Robert Mitchum, All’alba non sarete vivi (1948) di Rudolph Maté, I cavalieri dell’onore (1949) di Leslie Fenton, remake di I cavalieri del Texas (1936) di King Vidor, - ma la vera affermazione arriva con l’incontro - fondamentale per la sua carriera cinematografica - con il grande Billy Wilder, il quale lo dirigerà in personaggi passati alla storia del cinema: l’ambiguo sceneggiatore fallito di Viale del tramonto (1950), con la diva del muto Gloria Swanson, Erich von Stroheim e Nancy Olson, il caparbio prigioniero del campo tedesco di Stalag 17 - L’inferno dei vivi (1953), con cui vince l’Oscar come Miglior Attore Protagonista, ed il ricco dongiovanni di Sabrina (1954), con Audrey Hepburn, Humphrey Bogart e Martha Hyer.

Divenuto uno fra gli attori più noti della sua generazione (insieme ai quasi coetanei Robert Taylor, Stewart Granger, Alan Ladd, Burt Lancaster, Richard Widmark, Sterling Hayden, Gregory Peck, Glenn Ford, Kirk Douglas, Robert Mitchum), è l’affascinante straniero di Picnic (1956) di Joshua Logan, con Kim Novak e Cliff Robertson, ed il prigioniero americano nel kolossal bellico Il ponte sul fiume Kwai (1957) di David Lean, con Alec Guinness, Jack Hawkins e Sessue Hayakawa.

Attore molto versatile, dall’iniziale rappresentazione del tipico bravo ragazzo americano, bello e simpatico, passa ad interpretare ogni tipo di ruoli, drammatici, cinici, ironici o ambigui dando prova di tutto il suo eclettismo.

Si cimenta con ottimi risultati anche nel western: L’assedio delle sette frecce (1953) di John Sturges, con Eleanor Parker e John Forsythe, Soldati a cavallo (1959) di John Ford, con John Wayne, Alvarez Kelly (1966) di Edward Dmytryk, con Richard Widmark, ed il celebre Il mucchio selvaggio (1969) di Sam Peckinpah, con Ernest Borgnine, Robert Ryan e L. Q. Jones.

Appassionato viaggiatore ed accanito bevitore, a partire dalla fine degli anni Sessanta dirada le sue apparizioni, sia pur continuando a spaziare in vari generi: il catastrofico (L’inferno di cristallo - 1974 - di John Guillermin ed Irvin Allen, con Paul Newman, Faye Dunaway, Steve McQueen, e il modesto Ormai non c’è più scampo - 1980 - di James Goldstone, ancora con Paul Newman), il film di denuncia (Quinto potere - 1976 - di Sidney Lumet, con Peter Finch, Faye Dunaway e Robert Duvall considerato - insieme a Quarto potere di Orson Welles, L’asso nella manica di Billy Wilder, L’ultima minaccia di Richard Brooks, Un volto nella folla di Elia Kazan, Prima pagina di Billy Wilder, Tutti gli uomini del Presidente di Alan J. Pakula, Diritto di cronaca di Sydney Pollack, Sotto tiro di Roger Spottiswoode e Broadcast News - Dentro la notizia di James L. Brooks  - come uno fra i migliori film americani sul giornalismo mai realizzati), la commedia amara e cinica (S.O.B. - 1981 - di Blake Edwards, con Julie Andrews). Insieme a Robert Mitchum e Richard Widmark, William Holden è senz’altro l’attore della Hollywood classica degli anni Quaranta e Cinquanta che più è riuscito a adattarsi allo stile della cosiddetta “New Hollywood” di fine anni Sessanta/inizio Settanta.

Fra gli altri film ricordiamo Nata ieri (1950) di George Cukor, con Judy Holiday, L’ultima preda (1950) di Rudolph Maté, con Nancy Olson, Lyle Bettger e Jan Sterling, Squali d’acciaio (1951) di John Farrow,  La vergine sotto il tetto (1953) di Otto Preminger, con David Niven, La sete del potere (1954) di Robert Wise, La ragazza di campagna (1954) di G. Cukor, con Grace Kelly (Oscar come Miglior Attrice Protagonista) e Bing Crosby, I ponti di Toko-Ri (1954) di Mark Robson, in cui recita nuovamente con G. Kelly, Anche gli eroi piangono (1956) di George Seaton, La chiave (1958) di Carol Reed, con Sophia Loren, Il mondo di Suzie Wong (1960) di Richard Quine, Storia cinese (1962) di Leo McCarey, Il falso traditore (1962) di George Seaton, Il leone (1962) di Jack Cardiff, Insieme a Parigi (1964) di Richard Quine, in cui recita nuovamente con Audrey Hepburn un decennio dopo il già citato Sabrina di Billy Wilder,  La settima alba (1964) di Lewis Gilbert, La brigata del diavolo (1968) di Andrew V. McLagen, L’albero di Natale (1969) di Terence Young, Uomini selvaggi (1971) di Blake Edwards, con Ryan O’ Neal, La feccia (1972) di Daniel Mann, Breezy (1973) di Clint Eastwood, Le mele marce (1974) di Peter Collinson, Fedora (1978) di Billy Wilder, con Marthe Keller, Hildegard Knef e José Ferrer, La maledizione di Damien (1978) di Don Taylor, Ashanti (1979) di Richard Fleischer, con Michael Caine, Beverly Johnson, Peter Ustinov, Omar Sharif e Kabir Bedi, Il bambino e il grande cacciatore (1980) di Peter Collinson, con Ricky Schroder.