Nato a New York da un attrice di teatro e un attore radiofonico, Robert Francis Vaughn - meglio noto come Robert Vaughn -, in seguito al divorzio dei suoi genitori, vive a Minneapolis - nel Minnesota - con i suoi nonni. Frequenta la North High School e successivamente si iscrive alla facoltà di giornalismo dell'Università del Minnesota, che lascia dopo un anno per trasferirsi a Los Angeles.

Qui si iscrive al Los Angeles City College, trasferendosi poi al Los Angeles State College of Applied Arts and Sciences, dove consegue un master in teatro. Continuando la sua istruzione superiore, pur essendo impegnato con successo nella sua carriera di attore, molti anni dopo - nel ’70 - conseguirà un Ph.D. nelle comunicazioni presso la University of Southern California.

Fa il suo debutto televisivo nel ‘55 in Venerdì nero, episodio della serie televisiva Medic, il primo di oltre duecento ruoli che, per oltre cinquant’anni, interpreterà in episodi di noti telefilm, fra cui ricordiamo Gunsmoke, Zorro, Dottore di frontiera (dove appare con Virginia Christine nel noto episodio The Twisted Road), Bonanza, Il virginiano, Perry Mason, La parola alla difesa, Gli invincibili, Ironside, Il Tenente Colombo (compreso il noto episodio Assassinio a bordo - 1975 -, diretto da Ben Gazzara), Capitani e re, Colorado, Il grigio e il blu, La signora in giallo, il film tv Perry Mason: una ragazza intraprendente, Così gira il mondo, Walker Texas Ranger, Una vita da vivere, Un detective in corsia, La tata, Law & Order - I due volti della giustizia, Hustle - I signori della truffa, Law & Order - Unità vittime speciali, e molti altri.

Dal ‘64 al ‘68 interpreta Napoleon Solo, l’agente segreto protagonista della serie televisiva Organizzazione U.N.C.L.E., in cui lavora con David McCallum.

Al cinema esordisce in ruoli secondari ne I quattro cavalieri del terrore (1957) di Franklin Andreon e Rapina a San Francisco (1957) di David Lowell Rich.

Dopo il western Domani m’impiccheranno (1958) di Nathan Juran, in cui lavora con Fred MacMurray,  ottiene una Nomination all'Oscar come  Miglior Attore non Protagonista per I segreti di Filadelfia (1959) di Vincent Sherman.

Nel ’60 interpreta il tormentato Lee - con il sistema nervoso rovinato da troppi anni di vita da cacciatore di taglie - uno fra i sette pistoleri professionisti ingaggiati dai contadini di un povero villaggio messicano per proteggerli dai banditi nel celeberrimo western I magnifici sette di John Sturges, in cui lavora con Yul Brynner (1920-1985) Eli Wallach (1915-2014) Steve McQueen (1930-1980), Charles Bronson (1921-2003), James Coburn (1928-2002), Brad Dexter (1917-2002), e Horst Bucholtz (1933-2002).

Dal 2003 - dopo la scomparsa di Charles Bronson, ed escludendo Eli Wallach, che nel film interpretava Calvera, il cinico capo dei banditi - Robert Vaughn era l’ultimo fra i “magnifici sette” ancora in vita.

Più volte candidato al Golden Globe, fra gli altri film ricordiamo Il grande spettacolo (1961) di James B. Clark, Donne inquiete (1963) di Hall Bartlett (futuro regista de Il gabbiano Jonathan Livingstone - 1973 -, tratto dall’omonimo libro bestseller di Richard Bach del 1970), tre film tratti dalla già citata serie di spionaggio U.N.C.L.E (Una spia di troppo- 1966 - di Joseph Sargent, La mia spia di mezzanotte - 1966 - di Frank Tashlin, La spia che non fece ritorno - 1967 - di E. Darrell Hallenbeck), Gli assassini del karatè (1967) di Barry Shear, Bullitt (1968) di Peter Yates, in cui lavora nuovamente con Steve McQueen, Il ponte di Remagen (1969) di John Guillermin, Il cervello di Mr Soames (1970) di Alan Cooke, Il piccione d’argilla (1971) di Late Slate e Tom Stern, il celebre film catastrofico L’inferno di cristallo (1974) di Irwin Allen e John Guillermin, in cui lavora con Paul Newman, Steve McQueen, Faye Dunaway e William Holden, Obiettivo Brass (1978) di John Hough, I magnifici sette nello spazio (1980) di Jimmy T. Murakami, S.O.B. (1981) di Blake Edwards, Superman III (1983) di Richard Lester, Il giorno della luna nera (1986) di Harley Cokeliss, Passi di follia (1995) di Bill Corcoran, Basketball (1998) di David Zucker, Pootie Tang (2001) di Louis C.K., The Magnificient Eleven (2012) di Jeremy Wooding.

Negli anni Ottanta interpreta il ruolo del Generale Hunt Stockwell nella quinta stagione della serie televisiva A-Team (1986-1987) e lavora anche in Italia, in Killing Birds (1987) di Claudio Lattanzi, e soprattutto in Renegade - Un osso troppo duro (1987) di Enzo Barboni,  in cui è l’antagonista di Terence Hill.